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1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

內(nèi)生真菌BJM-11分離自從廣西百色采集的生姜健康根系，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為綠色木霉(Trichodermaviride)，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所土壤微生物研究室分離保存(保藏編號(hào)為CGMCCNO.17196)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1溫度對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響將內(nèi)生真菌BJM-11在PDA平板上25℃下培養(yǎng)3d后，從平板邊緣取4mm菌餅接種于PDA培養(yǎng)基，然后分別于5、10、15、20、25、30、35和40℃條件下恒溫培養(yǎng)，保持黑暗，48h后十字交叉測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.2.2pH對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0(PDA培養(yǎng)基在pH低于4.0時(shí)無(wú)法凝固)，將直徑約4.0mm的BJM-11菌餅接種于上述不同pH的PDA平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)，保持黑暗，48h后測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.2.3光照對(duì)內(nèi)生真菌BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響將接種直徑約4.0mmBJM-11菌餅的PDA平板分別置于光照條件設(shè)定為24h連續(xù)黑暗、24h連續(xù)光照和12h光暗交替(12h光照+12h黑暗)的恒溫培養(yǎng)箱中，25℃培養(yǎng)，48h后測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.2.4碳源對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響以查氏培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，以葡萄糖、木糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麥芽糖8種供試碳源等量替換(添加量均為3%)蔗糖配制成含不同碳源的培養(yǎng)基，將直徑約4.0mm的BJM-11菌餅接種于上述碳源培養(yǎng)基中央，每處理5次重復(fù)，25℃恒溫培養(yǎng)，保持黑暗，48h后測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.2.5氮源對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響以查氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以鉬酸銨、硝酸銨、亮氨酸、酵母浸粉、尿素、硝酸鉀、胰蛋白胨、甲硫氨酸、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏11種氮源等量替換(添加量均為0.2%)硝酸鈉配制成含不同氮源的培養(yǎng)基，接種直徑約4.0mm的BJM-11菌餅，每處理5次重復(fù)，25℃恒溫培養(yǎng)，保持黑暗，48h后測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.2.6不同培養(yǎng)基對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響將直徑約4.0mm的BJM-11菌餅分別接種到PDA、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)、玉米粉瓊脂(CMA)、查氏和NA5種培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)，保持黑暗條件，48h后測(cè)量菌株BJM-11的菌落直徑，7d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理5次重復(fù)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同溫度對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖1-A可看出，菌株BJM-11在10～35℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，在20～30℃范圍內(nèi)菌絲生長(zhǎng)較好，在25℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最好，在10和35℃條件下菌絲生長(zhǎng)緩慢，在5和40℃時(shí)幾乎無(wú)法生長(zhǎng)。其中，菌株BJM-11在25和30℃時(shí)的菌落直徑較大，二者差異不顯著(P>0.05，下同)，但均顯著大于其他溫度處理(P<0.05，下同)。從圖1-B可看出，菌株BJM-11在10～35℃溫度范圍內(nèi)均能產(chǎn)孢，適合產(chǎn)孢的溫度范圍為20～30℃，在5和40℃時(shí)幾乎無(wú)法產(chǎn)孢。其中，在溫度為25℃時(shí)產(chǎn)孢量最大，且顯著大于其他溫度處理，在溫度為30和20℃時(shí)次之，二者差異不顯著，但均顯著大于其他溫度處理。綜上所述，25和30℃較適宜菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。

2.2不同pH對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖2-A可看出，菌株BJM-11在pH4.0～12.0范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，在pH4.0～10.0范圍內(nèi)菌絲生長(zhǎng)較好。其中pH為5.0和6.0時(shí)的菌落直徑較大，二者差異不顯著，但均顯著大于其他pH處理；從圖2-B可看出，菌株BJM-11在pH4.0～12.0范圍內(nèi)均可產(chǎn)孢，pH4.0～10.0范圍內(nèi)產(chǎn)孢量效果較佳。其中菌株BJM-11在pH為5.0、6.0和7.0時(shí)的產(chǎn)孢量較大，三者差異不顯著，但均顯著大于其他pH處理。綜上所述，pH為5.0和6.0時(shí)較適宜菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)，pH為5.0、6.0和7.0時(shí)較適宜菌株BJM-11產(chǎn)孢。

2.3不同光照條件對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖3-A可看出，菌株BJM-11在24h連續(xù)光照、24h連續(xù)黑暗和12h光暗交替條件下均可生長(zhǎng)。其中24h連續(xù)黑暗處理的菌落直徑最大，且顯著大于其他光照處理。從圖3-B可看出，菌株BJM-11在24h連續(xù)光照、24h連續(xù)黑暗和12h光暗交替條件下均可產(chǎn)孢。其中在24h連續(xù)光照條件下產(chǎn)孢量最大，且顯著大于其他光照處理。

2.4不同碳源對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖4-A可看出，菌株BJM-11在供試的8種碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，在碳源為葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麥芽糖時(shí)菌絲生長(zhǎng)較好，在碳源為木糖時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢。其中碳源為葡萄糖和可溶性淀粉時(shí)菌落直徑較大，二者差異不顯著，但碳源為葡萄糖處理的菌落直徑顯著大于其他碳源處理；從圖4-B可看出，菌株BJM-11在供試的8種碳源培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢，適合產(chǎn)孢的碳源為葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麥芽糖。其中碳源為甘露醇時(shí)，菌株BJM-11的產(chǎn)孢量最大，且顯著大于其他碳源處理。

2.5不同氮源對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖5-A可看出，菌株BJM-11在供試的11種氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，在氮源為鉬酸銨、硝酸銨、亮氨酸、酵母浸粉、硝酸鉀、胰蛋白胨、甲硫氨酸、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏時(shí)菌絲生長(zhǎng)較好，在氮源為尿素時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢。其中氮源為酵母浸粉和蛋白胨時(shí)，菌株BJM-11的菌落直徑較大，二者差異不顯著，但均顯著大于其他氮源處理。從圖5-B可看出，菌株BJM-11在供試的11種氮源培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢，適合產(chǎn)孢的氮源為鉬酸銨、硝酸銨、亮氨酸、酵母浸粉、硝酸鉀、胰蛋白胨、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏，不適合產(chǎn)孢的氮源為尿素和甲硫氨酸。其中氮源為蛋白胨時(shí)，菌株BJM-11的產(chǎn)孢量最大，且顯著大于其他氮源處理。

綜上所述，以酵母浸粉或蛋白胨為氮源較適宜菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)，以蛋白胨為氮源較適宜菌株BJM-11產(chǎn)孢。

2.6不同培養(yǎng)基對(duì)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響結(jié)果

從圖6-A可看出，菌株BJM-11在PDA、PSA、CMA、查氏和NA5種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。其中培養(yǎng)基為PDA和PSA時(shí)，菌株BJM-11的菌落直徑較大，二者差異不顯著，但均顯著大于其他培養(yǎng)基處理。從圖6-B可看出，菌株BJM-11在PDA、PSA、CMA、查氏和NA5種培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢。其中培養(yǎng)基為PDA時(shí)，菌株BJM-11的產(chǎn)孢量最大，且顯著大于其他培養(yǎng)基處理。綜上所述，以PDA或PSA為培養(yǎng)基較適宜菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)，以PDA為培養(yǎng)基較適宜菌株BJM-11產(chǎn)孢。

3討論

內(nèi)生真菌是定殖于宿主植物組織、但不引起宿主植物產(chǎn)生明顯病變的一類(lèi)真菌[18]，其在植物體內(nèi)生長(zhǎng)定殖是共同進(jìn)化選擇的結(jié)果，在進(jìn)化過(guò)程中二者形成了互惠共生關(guān)系，使內(nèi)生真菌產(chǎn)生與植物相同或相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物[18-19]。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物主要是抗生素類(lèi)和水解酶類(lèi)物質(zhì)，能促進(jìn)作物生長(zhǎng)并抑制病原菌生長(zhǎng)[20]。自Stierle等[21]從藥用植物紅豆杉韌皮部分離到1株能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌后，學(xué)者們才探索將內(nèi)生真菌尤其是藥用植物內(nèi)生真菌作為新型藥用活性成分的重要潛在原料[22]，此后對(duì)藥用真菌內(nèi)生真菌的研究應(yīng)用迅速成為熱點(diǎn)，但針對(duì)生姜內(nèi)生真菌的相關(guān)研究?jī)H見(jiàn)Anisha等[23-25]從生姜中分離篩選到3株對(duì)生姜莖腐病菌具有明顯拮抗活性?xún)?nèi)生真菌Rhizopycnisvagum、Paraconiothyriumsp.和Acremoniumsp.及Ginting等[26]從生姜中分離篩選到3株對(duì)尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum并分別鑒定為Curvulariaaffinis、Fusariumsolani和Glomerellacingulata的報(bào)道。

木霉菌是防治作物土傳病害的重要拮抗真菌，種類(lèi)繁多，不同種及同種不同菌株在生態(tài)學(xué)特性等方面存在明顯差異[27-30]。本研究中，菌株BJM-11喜偏酸環(huán)境條件，在25～30℃及光照條件下其菌絲生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量均較大，與劉連妹[31]、紀(jì)明山[32]對(duì)綠色木霉菌株的研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株BJM-11的生態(tài)學(xué)特性也與其他報(bào)道[31-32]存在差異，如對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較窄，35℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢且完全不能產(chǎn)孢，可能與其宿主生姜生長(zhǎng)喜陰涼不耐高溫有關(guān)。在利用碳源方面，菌株BJM-11在碳源為葡萄糖時(shí)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)較佳，與綠色木霉HT-01[31]和TR-8[32]的特性相似，但菌株BJM-11以甘露醇為碳源時(shí)產(chǎn)孢量最大，與綠色木霉HT-01[31]和TR-8[32]產(chǎn)孢的最佳碳源為葡萄糖不一致。在氮源利用方面，菌株BJM-11在氮源為蛋白胨時(shí)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢狀況較好，其次為亮氨酸，與綠色木霉TR-8[32]營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適氮源為天門(mén)冬酰胺、亮氨酸不利于產(chǎn)孢的特性不一致；尿素不利于菌株BJM-11生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，與綠色木霉TR-8[32]對(duì)氮源利用特性一致。綜合分析認(rèn)為，在發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖或可溶性淀粉、氮源為酵母浸粉或蛋白胨時(shí)菌株BJM-11菌絲生長(zhǎng)速度較快，在碳源為甘露醇、氮源為蛋白胨時(shí)菌株BJM-11產(chǎn)孢量較大，可用于指導(dǎo)其發(fā)酵生產(chǎn)。目前關(guān)于菌株BJM-11對(duì)生姜的促生作用及相互作用的機(jī)理還不清楚，有待深入探究。

4結(jié)論

菌株BJM-11在溫度25～30℃、pH5.0～6.0、連續(xù)黑暗及以葡萄糖或可溶性淀粉為碳源、以蛋白胨或酵母浸粉為氮源、培養(yǎng)基為PDA或PSA條件下菌絲生長(zhǎng)狀況較佳，在溫度25～30℃、pH5.0～7.0、連續(xù)光照及以甘露醇為碳源、以蛋白胨為氮源、培養(yǎng)基為PDA條件下產(chǎn)孢量較大，可供開(kāi)發(fā)利用BJM-11菌株參考。

作者：劉增亮 汪茜 宋娟 周雙云 覃曉娟 車(chē)江旅 陳廷速 單位：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所